上海信帆生物：TUNEL检测选择指南

细胞凋亡一直都是细胞生物学研究的热点，这个复杂的过程涉及多条通路，可以用多种方法在不同的阶段进行检测。细胞凋亡晚期，细胞核发生形态变化、染色质凝聚、核膜降解、DNA片段化。
TUNEL（脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）介导的缺口末端标记法）是检测DNA片段化的成熟方法，自1992年发表以来经过不断改进，纵横实验室逾20年，至今仍然是广泛采用的凋亡检测方法，这是因为TUNEL能够与其他细胞学技术很好的契合。比如，使用TUNEL分析进行凋亡研究有一个好处，研究人员在TUNEL法标记细胞之后，在直接检测和定位凋亡信号的同时，还可以通过抗体在同一个样本上检测细胞表面和细胞内的生物学指标。
TUNEL的基本原理：DNA断裂时会产生大量的粘性3'-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将生物素或荧光素或digaoxin标记的dUTP掺入到DNA的3'-末端，可通过一定的显色系统使之显示出来。过去，TUNEL算得上是个值得“用心摸索”的试剂盒，因为有点技术难度。如今市场上的TUNEL检测产品有了哪些改进和新选择呢？ 
考虑通透性和标记
TUNEL检测的一个关键要素是把握好细胞透化的时间。透化的目的是通透细胞膜和核膜，通俗说就是在膜上打孔，让反应试剂得以充分进入细胞核进行反应，提高检测效果。门开小了大家俬不好进场，若透化不足可能检测不到凋亡的特征，造成假阴性。可开孔太过又影响形态，透化时间太长还容易脱片。 
DNA的标记是另一个重要的影响因素。标记分子太大则不利于TdT将其掺入DNA片段。早期的分析中dUTP通常用生物素或荧光素标记，由于荧光基团的“大块头”，使得其标记的dUTP掺入DNA的效率要低于预期。后来改进为利用Br-dUTP来取代生物素或荧光素标记的dUTP，因为溴分子比荧光素、生物素等标记物要小得多，因此Br-dUTP更容易被掺入凋亡细胞的DNA片段中，再经过Br-dUTP抗体识别、以及抗体上偶联的生物素或荧光素放大或显色，使得zui后的检测信号也更强。但是，Br-dUTP要用抗体检测，要求严谨的反应条件。
更好的选择是EdUTP，这种以炔烃基团（一种小分子基团）修饰的dUTP比Br-dUTP更小，更容易被TdT掺入到DNA末端。更妙的是，EdUTP的检测不需要经过抗体，而是通过一步高度特异性的click反应（一种铜催化的叠氮化物与炔烃之间的反应），将掺入DNA的EdUTP上的炔烃基团，与叠氮化合物（偶联生物素或荧光素）共价连接，再借助叠氮化物上的生物素或荧光标记，可实现灵敏的TUNEL检测。与BrdU抗体（分子量约为150 kDa）相比，这个叠氮化物的大小仅为1%（分子量<~1000 Da），通透性要好得多。 
click技术的优势在于叠氮化物和炔烃都是极小的惰性基团，因此，只需要温和的固定和透化条件，即可达到让试剂充分渗透进入细胞核。同时，高度特异的click反应可实现更低的背景干扰，和更稳定的共价结合产物，从而更好地检测凋亡细胞。此外，升级版的Click-iT Plus技术无需铜的参与，染料兼容性更广泛，在多色检测中表现更出色。

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