丙酮酸脱氢酶（PDH）试剂盒的测定步骤，注意事项以及计算方法

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测定步骤

1. 调零

用蒸馏水于605nm处调零。

1. 样本测定

（1）取900μL工作液加入1mL玻璃比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中孵育5min。

（2）取出比色皿，加入50μL酶液，混匀；立即记录605nm处初始吸光值A1，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应1min，记录605nm处1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

丙酮酸脱氢酶（PDH）试剂盒注意事项

1、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

PDH活性计算

1、组织中PDH活性计算:

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

 PDH活性（U/mg prot）=反应总体积（950μL）÷样本体积（50μL）÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数（21×10^-3）×ΔA ÷蛋白浓度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL)

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

 PDH（U/g 鲜重）=反应总体积（950μL）÷样本体积（50μL）÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数（21×10^-3）×ΔA ÷样本鲜重(g/mL)=905×ΔA ÷样本鲜重(g/mL)

2、细菌或培养细胞中PDH活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

 PDH活性（U/mg prot）=反应总体积（950μL）÷样本体积（50μL）÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数（21×10^-3）×ΔA ÷蛋白浓度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL)

（2） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/10⁴ cell）=反应总体积（950μL）÷样本体积（50μL）÷反应时间(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系数（21×10^-3）×ΔA ÷细菌或细胞密度(10⁴ cell /mL)=905×ΔA÷细菌或细胞密度(10⁴ cell /mL)

丙酮酸脱氢酶（PDH）试剂盒