NF-κB在患者外周血核细胞TNFα和IL-6表达作用

 血液透析是慢性肾功能衰竭(CRF)的替代治疗方法之一,营养不良、动脉粥样硬化、淀粉样变、感染等是维持性血液透析(MHD)常见并发症,发生率高,是影响患者生活质量和存活率的重要因素.目前认为,在透析相关并发症的发生发展中,MHD患者外周血单个核细胞(PBMC)中促炎症介质白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)等异常高表达起着关键作用,降低其表达可降低血液透析相关并发症的发生率,减轻其严重程度,延缓其发展；核因子-κB(Nuclearfactor-κB,NF-κB)是序列特异的转录因子,对IL-6、TNFα等促炎症介质基因和蛋白质的表达起关键的调控作用.因此,研究MHD患者NF-κB信号途径的活化状态,及其在TNFα和IL-6表达中的作用将有助于深入探讨MHD患者血液透析相关并发症的发病机制和探索有效的治疗方法.
   为此,本文将从下列几个方面对其进行研究:（1）观察MHD患者透析前PBMCTNFα和IL-6表达水平及其对脂多糖(LPS)刺激的反应性；（2）观察MHD患者透析前PBMC NF-κB活化水平,及其与TNFα和IL-6表达的关系,观察NF-κB特异性抑制剂吡咯啉烷二甲基硫脲(PDTC)对PBMC NF-κB活化及TNFα、IL-6表达的影响,探讨NF-κB在MHD患者PBMC TNFα和IL-6表达中的作用；（3）在单次血液透析中,观察二醋酸纤维素膜（CDA膜）和聚砜膜（PS膜）MHD患者血液透析前后PBMC NF-κB活性水平的变化,及NF-κB信号途径对透析4h后PBMC TNFα和IL-6表达的影响,探讨不同透析膜对MHD患者PBMC NF-κB信号途径活性的影响及意义.
   一、MHD患者透析前PBMC TNFα和IL-6表达水平的观察
   研究对象为使用同种膜材料透析器超过6个月的MHD患者26例,其中CDA膜15例,PS膜11例,碳酸氢盐透析,每次4h,每周3次,血流量200～280 ml/min,透析液流量500ml/min；健康志愿者10例,尚未行肾脏替代治疗的CRF患者12例（非透析CRF组）.采外周血25mL,梯度密度离心法制备新鲜PBMC,5％新生牛血清RPMI1640培养（5％〓、37℃）,培养分组为:（1）LPS刺激组（LPS终浓度为1mg/L,LPS组）；（2）单纯含5％新生牛血清的RPMI1640培养基（单纯培养组）.血浆和PBMC培养上清液IL-6和TNFα采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定,培养PBMC IL-6和TNFαmRNA采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)法检测,血C-反应蛋白(CRP)水平采用免疫浊度法测定.结果显示:（1）单纯培养基培养下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜组患者PBMC培养上清液IL-6含量分别为4.67、5.79、6.55和6.28(ng/mL),TNFα含量分别为475.7、545.7、654.5和641.4(pg/mL),IL-6mRNA表达量分别为0.12、0.21、0.35和0.33（吸光度A值）,TNFαmRNA表达量分别为0.66、0.85、1.14和1.09（吸光度A值）,上述结果比较,PS膜组和CDA组MHD患者PBMC IL-6、TNFαmRNA和蛋白质表达均高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜组与CDA膜组间比较差异没有显著性（P>0.05）,非透析CRF患者高于健康人（P<0.05）.（2）LPS刺激下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜组患者PBMC IL-6、TNFα蛋白质和mRNA表达均高于单纯培养组（P<0.01）,且PS膜组和CDA膜组患者高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜组与CDA膜组间差异没有显著性（P>0.05）.（3）健康人、非透析CRF、MHD患者血浆IL-6浓度分别为16.7、26.2、25.6和26.8（pg/mL）,TNFα浓度分别为42.9、56.3、58.6和54.1（pg/mL）,非透析CRF、CDA膜和PS膜组患者血浆IL-6和TNFα浓度均高于健康人（P<0.05）,它们三者间差异没有显著性（P>0.05）.（4）CDA膜和PS膜组患者血CRP水平高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜与CDA膜组间差异没有显著性（P>0.05）；CDA膜和PS膜组患者血浆白蛋白水平低于健康人（P<0.05）.（5）相关分析显示,MHD患者PBMC TNFαmRNA和蛋白质表达与血CRP水平呈正相关（r=0.61和r=0.68,P<0.05）,与血浆白蛋白呈负相关（r=-0.57和r=-0.62,P<0.05）；IL-6 mRNA和蛋白质表达与血CRP水平呈正相关(r=0.66和r=0.71,P<0.05）,与血浆白蛋白呈负相关（r=-0.66和r=-0.53,P<0.05）.
   结果提示,MHD患者透析前即存在PBMC TNFα、IL-6 mRNA和蛋白质异常高表达,PBMC对LPS的反应性也明显增高；MHD患者PBMC TNFα、IL-6 mRNA和蛋白质异常高表达与血CRP水平呈正相关,与血浆白蛋白呈负相关.
   二、MHD患者透析前PBMC NF-κB活性水平观察及其对TNF-α和IL-6表达的影响
   研究对象同*部分.采外周血25mL,梯度密度离心法制备新鲜PBMC,5％新生牛血清RPMI1640培养24h,分别加入:（1）终浓度为1mg/L的LPS（LPS组）；（2）终浓度为100pmol/mL的PDTC（PDTC组）；（3）先加入终浓度为100pmol/mL的PDTC培养10min,然后加入终浓度为1mg/L的LPS（LPS+PDTC组）；（4）单纯含5％新生牛血清的RPMI1640培养基（单纯培养组）.RT-PCR法检测PBMC IL-6和TNFα mRNA,ELISA法测定培养上清液IL-6和TNFα,电泳迁移率改变实验(EMSA)及图象分析技术测定NF-κB活性.结果发现,（1）单纯培养基培养下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜组患者PBMC NF-κB活性分别为0.30、0.53、0.77和0.74（吸光度A值）,CDA膜组和PS膜组MHD患者高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,CDA膜组与PS膜组间差异没有显著性（P>0.05）,非透析CRF患者高于健康人（P<0.05）；LPS刺激下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜组患者PBMC NF-κB活性分别为1.17、1.95、2.24和2.17（吸光度A值）,均高于单纯培养时（P<0.01）,且PS膜组和CDA膜组患者高于健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜组与CDA膜组间差异没有显著性（P>0.05）,非透析CRF患者高于健康人（P<0.05）.（3）在健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜组患者,NF-κB特异性抑制剂PDTC显著抑制单纯培养基培养或LPS刺激的PBMC NF-κB活性（P<0.01）,同时,明显抑制TNFα、IL-6 mRNA和蛋白质的表达（P<0.01）.（4）MHD患者PBMC NF-κB活性与血浆IL-6、TNFα水平呈正相关,相关系数分别为r=0.75和r=0.69（P<0.05）；与PBMC IL-6 mRNA和蛋白质表达呈正相关（r=0.65和r=0.85,P<0.05）,与PBMC TNFαmRNA和蛋白质表达也呈正相关（r=0.75和r=0.63,P<0.05）.
   上述结果提示,在单纯培养下,MHD患者透析前PBMC NF-κB信号途径呈高度活化,且与IL-6、TNFαmRNA和蛋白质异常高表达呈正相关；MHD患者PBMC NF-κB容易被LPS等刺激因素活化；PDTC可阻抑NF-κB活化,同时,显著抑制MHD患者PBMC IL-6、TNFαmRNA和蛋白质的表达；我们认为,NF-κB信号途径可能在MHD患者透析前PBMC IL-6和TNFα异常高表达中起重要作用.
   三、NF-κB对血液透析中PBMC TNFα和IL-6表达的影响
   研究对象、材料和方法同第二部分.结果发现:（1）血液透析4h后,CDA膜组患者PBMC NF-κB活性明显高于透析前（0.83 vs 0.77,A值,P<0.01）,培养上清液IL-6含量明显高于透析前（7.03 vs 6.55ng/mL,P<0.05）,TNFα含量明显高于透析前（706.7 vs 654.5pg/mL,P<0.01）,IL-6 mRNA表达明显高于透析前（0.46vs 0.35,A值,P<0.01）,TNFαmRNA表达明显高与透析前（1.23 vs 1.14,A值,P<0.01）,PS膜组患者透析前后PBMC NF-κB活性分别为0.74 vs 0.79（A值）,差异没有显著性（P>0.05）,透析前后IL-6 mRNA和蛋白质表达分别为0.32 vs 0.36（A值）和6.28vs6.44（ng/mL）,差异没有显著性（P>0.05）,TNFαmRNA和蛋白质表达分别为1.09vs 1.14（A值）和641.4 vs 661.5（pg/mL）,差异没有显著性（P>0.05）.（2）血液透析4h后,PDTC（100pmol/mL）对单纯培养和LPS刺激下的PBMC NF-κB活性均有明显的抑制作用（P<0.01）,对PBMC IL-6、TNFα蛋白质和mRNA表达也有明显抑制作用（P<0.01）.（3）单纯培养下,MHD患者透析4h后PBMC NF-κB活性与培养上清液IL-6和TNFα含量呈正相关,相关系数分别为0.55和0.62（P<0.05）,与IL-6和TNFα mRNA表达量呈正相关,相关系数分别为0.70和0.66（P<0.05）.
   以上结果提示,在单次血液透析中,CDA膜可引起MHD患者PBMC NF-κB活性水平增高,且后者与透析4h后PBMC IL-6和TNFα表达增高密切相关；PS膜活化NF-κB能力较弱；阻抑NF-κB信号途径可下调透析4h后PBMC IL-6和TNFα的表达,提示NF-κB可能介导了单次血液透析中透析膜诱导的PBMC IL-6和TNFα的表达增高.
   总结
   本研究结果显示,MHD患者透析前即存在PBMC TNFα、IL-6 mRNA和蛋白质异常高表达；PBMC NF-κB呈异常高活化,且与IL-6、TNFαmRNA和蛋白质异常高表达呈正相关；PDTC可阻抑NF-κB活化,同时显著抑制PBMC IL-6、TNFαmRNA和蛋白质的表达.在单次血液透析中,CDA膜血液透析可活化PBMCNF-κB,且后者与透析后PBMC IL-6和TNFα表达增高密切相关；阻抑NF-κB信号途径可下调透析4h后PBMC IL-6和TNFα的表达.本研究结果初步显示NF-κB信号途径可能介导了MHD患者PBMC IL-6和TNFα的表达,为探讨MHD患者透析并发症的发病机制和探索治疗方法提供新的思路和线索.