ELISA试剂盒研究----DNA氧化损伤产物8-OHdG在终末期肾病表达

     经研究证实，终末期肾病（ESRD）患者存在氧化损伤增强。ESRD患者体内某些细胞因子（IL-1、IL-6、TNF等）分泌增加，可使中性粒细胞、单核-巨噬细胞等炎症细胞的呼吸爆发活动增强，活性氧（ROS）和活性氮（RNS）大量生成。

       ROS和RNS可攻击细胞内任何结构和物质，包括：DNA。DNA氧化损伤产物中，作为DNA中脱氧鸟苷（dG）的羟基加合物，8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）因其形成量大，影响因素少，已被*为zui能反映体内DNA氧化损伤程度的生物标志物。然而目前对ESRD的DNA的氧化损伤研究尚少。本研究通过检测血清中的8-OHdG含量来了解ESRD患者体内DNA氧化损伤程度，同时研究不同病因（慢性肾小球肾炎和糖尿病）所致ESRD在DNA氧化损伤程度上是否有差别，以及血液透析和抗氧化治疗对DNA氧化损伤的影响。本研究还检测了ESRD患者一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）的含量，并通过与8-OHdG比较，来了解DNA氧化损伤与其他物质氧化损伤的相关性。以此达到探讨ESRD患者体内氧化损伤的机制，并为ESRD的抗氧化治疗提供理论依据的目的。 实验材料与方法 一、实验材料 1．主要试剂与仪器 8-OHdG ELISA试剂盒购自日本防老化研究所（Japan Institute For The Control Of Aging）；镉颗粒购自上海化学试剂站；722光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂）；酶标仪（芬兰产，Multi-skan Ascent牌） 二、实验方法 二．研究对象： 分四组，每组10例。除正常对照组外，其余三组为实验组。*组为正常对照组。第H组为慢性肾小球肾炎导致ESRD未接受血液透析治疗组＊N非透析组人第三组为糖尿病导致ESRD末接受血液透析治疗组pM非透析组八第四组为慢性肾小球肾炎导致ESRD接受血液透析治疗组＊N透析组人 以上各组除第四组外，所有受检者均要求无吸烟史，无肿瘤病史；近一月无感染史，近一月无口服VOVD铁剂史。第四组均为接受血液透析治疗三个月以上，要求除口服VOV卜铁剂史外，其余同其他三组。 2．检测方法： 8－OHdG检测采用 ELISA试剂盒法，依次加人*抗体液、第二抗体液后，再加人发色剂及反应停止液，然后酶标仪波长450run处8－OHdG定量分析。NO采用检测改良镀铜辐颗粒还原法。MDA检测采用硫代巴比妥酸产物比色法。 三、统计分析 实验数据采用SPSS．0统计分析软件进行描述分析t检验及数据相关分析，数据以 i幻表示，p＜0．05为统计学有意义。 结 果 一、各组间血清 8－OHdGJDA和 NO测量值 l．各组的血清8－OHdG水平 GN非透组刀M非透组人N透析组血清中8—OHdG水平均显著高于正常对照组，p＜0．0L但各实验相比鳅显著差异，p＞0．05。 ·2·． 2．各组的血清MDA水平 GN非透组山M非透组血清中MDA水平均显著高于正常对照组，p＜0．of。实验组中 GN非透组与 GN透析组相比差异显著，P＜0．01。 3．各组的血清NO水平 GN非透组山M非透组血清中NO水平均显著高于正常对照组，其中＊N非透组对比正常对照组p＜o．o＼＊M非透组与正常对照组比 p＜0．05。但 GN非透组的 NO水平明显高于 DM非透组，差异显著，p北·01。 二、不同氧化损伤指标与肌酥的相关分析 l．血清8－OHdG值同NO和o值呈正相关，相关系数分别为0．379和0．596。其中 8－OHdG值和 Cr值呈较强正相关，P＜0．of。 2．血清 NO值与 Cr值呈正相关，相关系数为0．378，P＜0．05。 讨 论 关于DNA氧化损伤的研究是近几年才开展起来的。在DNA氧化损伤产物中，8－OHdG产生量zui多。8－OHdG为 DNA中 dG的羟基（·OH）加合物。。OH的生成方式主要是Fenton反应（H。O。＋Fe‘“一＋HO＋Fe’”＋·OH），其中铁离子发挥着重要作用。以前8—OHdG的检测复杂，费用昂贵，限制了8－OHdG的应用。1997年日本防老化研究所研究出 ELISA方法检测 8－OHdG，可直接检测血清中的8－OHdG含量，大大地提高了8－OHdG作为一个DNA氧化损伤指标的应用，本研究也是基于此方法研究ESRD中 DNA氧化损伤水平。 我们的研究结果显示在ESRD患者8－OHdG水平明显高于 ·3·正常对照组。而且8－OHdG同患者体内Cr水平明显正相关，说明ESRD患者DNA氧化损伤增强是肾功能衰竭的结果。ESRD患者有多种因素导致Fenton反应增强。这些因素包括：ESRD患者促红细胞生成素减少等原因导致铁的利用减少和转运障碍。铁元素蓄积；患者营养不良、蛋白合成减少、体内微量元索硒重度减低等原因，导致GSH－PX和GSH抗氧化系统功能低下，体内·OH清除减少；SODJO＊抗氧化物缺乏等。

    本研究发现GN非透组和DM非透组之间8—OHdG的水平无差别，这与目前的一些研究结果不同。之所以不同的原因，我们考虑可能是因为检测标本有差别。（转自 论文网）