猪瘟抗体ELISA试剂盒的研制

      猪瘟抗体研究将含有编码猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因的表达质粒pETE2的重组菌转入受体菌BL21（DE3） plysS中，经IPTG的诱导，SDS-PAGE凝胶电泳分析，在约40Kda处有一特异表达的蛋白带与预计的E2蛋白的大小基本一致；Western-blot印迹表明，该蛋白带能与CSFV阳性血清发生特异反应。

    对大量重组菌的诱导表达，以包涵体的形式表达了具有抗原性的E2蛋白，收集菌体，冻融，超声波裂解，离心收集沉淀。再分别用1M NaCl，0.5％TritonX-100，2M尿素，3M尿素，4M尿素洗涤包涵体，SDS-PAGE电泳纯化E2蛋白，测定E2蛋白浓度，即为制备的基因工程抗原。

     以纯化的E2蛋白为抗原包被酶标板，通过对ELISA各反应条件的优化，确定了*反应条件：重组E2蛋白的*包被浓度为2μg／ml，zui适包被条件为4℃ 36h；*封闭液为1％BSA，封闭条件为37℃2h再加4℃12h；*血清稀释液为0.05％Tween-20／1％BSA／2％E．coli裂解液／PBS，血清稀释倍数为100倍，HRP-兔抗猪IgGzui适工作浓度为1：1100，*二抗稀释液为4％PEG6000／10％NCS／PBS，二抗工作时间为20 min。 采用已确立的ELISA反应条件，检测了150份CSFV阴性血清（经兔体中和试验和间接免疫荧光证实），根据试验结果，确定了间接ELISA方法阴阳血清的判定标准。板内、板间检测血清的变异系数均小于10％，对200份阴性血清的检测结果表明本方法的特异性达95％，用建立的ELISA方法与兔体中和试验、间接免疫荧光以及IDEXX公司的试剂盒进行比较，充分说明建立的以重组E2蛋白为抗原检测猪瘟病毒抗体间接ELISA方法敏感性，特异性都是很好的，达到国外同类方法的水平。在此基础上将成熟的ELISA技术试剂盒化，本试剂盒可操作性强，不需要配制额外试剂，3小时左右即可出结果，在4℃条件下可保存半年以上。

    用组装的试剂盒分别对新生仔猪母源抗体水平检测，规模化猪场猪群免疫状态的监测，发病猪场血清检测，基因疫苗免疫仔猪抗体水平检测，试验结果说明了本试剂盒能够准确客观地反映实际情况，进一步证明了本试剂盒的研制是成功的。