信帆生物：皮质醇ELISA试剂盒的正确操作方法

小鼠皮质醇（Cortisol）ELISA检测试剂盒的正确使用方法

信帆生物供应各类ELISA试剂盒，提供免费代测服务，产品质量稳定，库存充足。

【检验原理】

试剂盒采用酶联免疫分析方法。采用生物素标记Cortisol，纯化的抗Cortisol抗体包被微孔板，在竞争抑制反应中，一定量的固相抗体与生物素标记Cortisol及非标记抗原（校准品或标本）进行抑制竞争反应，抗体与生物素标记的Cortisol结合量受非标记抗原量所抑制，非标记抗原量多,抗体与生物素标记的Cortisol结合就少，反之结合就多；反应平衡后，形成固相抗体-生物素化Cortisol，再加入酶标记的亲和素，形成固相抗体-生物素化Cortisol-酶标-亲合素复合物。经加底物显色后，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值）。随着Cortisol浓度的升高，OD值逐渐下降呈良好的线性关系。本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简单、快速等特点，对血清中Cortisol的减少或升高有可靠的检出性能。

【主要组成成分】

主要成分

标准品浓度依次为：12、6、3、1.5、0.75、0 ng/mL本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。

需要但未提供的材料及耗材

 1、酶标仪

2、精密移液器及一次性吸头

3、蒸馏水

4、洗瓶或者自动洗板机

5、37℃水浴锅或恒温箱

6、500ml量筒

7、无粉一次性乳胶手套

【储存条件及有效期】

 1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。

 2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。

 3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为14天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。

【适用仪器】

 半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。

【样本要求】

 样本类型和采集

以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。

1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。

3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。

4、组织：用预冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1: 9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000×g离心 5-10分钟，取上清检测。

样本保存和稳定性

样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。

【检验方法】

试剂准备

1、使用前，所有的组分都要至少复温30min，确保充分复温到室温。

2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。

操作程序

1.      将各种试剂移至室温平衡两小时，取浓缩洗涤液，根据当批检测数量，用蒸馏水1：20稀释，混匀后备用。

2.      将预包被板从密封袋中取出，设一个空白对照孔，不加任何液体；每个校准品设2孔，每孔加入对应校准品50μl；其余每个检测孔直接加待测血清或质控品50μl。

3.      除空白孔外所有孔加入生物素化抗原50μl，混匀，贴上封板膜，置37℃温育60分钟。

4.      手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置10秒甩干，重复3次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤3次程序洗板后拍干。

5.      每孔加入酶标亲合素50μl（空白对照孔除外），混匀，贴上封板膜，置37℃温育30分钟。

6.      手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置10秒甩干，重复3次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤3次程序洗板后拍干。

7.      每孔加显色剂A 50μl，显色剂B 50μl，振荡混匀后，置37℃避光显色15分钟，每孔加终止液50μl。

8.      用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白对照孔调零点，然后测定各孔光密度值（OD值）。

【实验结果计算】

检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。

如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。

【检验方法的局限性】

1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。

2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。

3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。

4、使用试剂盒配套的样品稀释液。

5、如果样本值高于最高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。

6、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。

【产品性能指标】

1.  外观和物理检查:试剂盒应组分齐全，内外包装均应完整，标签清晰，液体试剂无渗漏。各组分装量不少于表1中要求。

2.  线性: 用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），在0.375 ng/mL – 12 ng/mL范围内，剂量-反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于0.9900。

3.  精密度

3.1分析内精密度:试剂盒质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于15.0%。

3.2批间精密度:在三个不同批次产品之间，质控品测定结果的变异系数（CV）应不大于15.0%

4.  低检出限:低检测浓度小于0.1 ng/mL。

5.       质控品测定值: 每次检测结果均应在允许范围内。

【注意事项】

生物安全

1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。

2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。

3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。戴上防护手套，实验完成后洗手。

技术提示

1、混合蛋白溶液时，避免起泡。

2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。

3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。

4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。

5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。

6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

废物处理

 所有使用或未使用的试剂，所有污染性的一次性材料，应当遵循传染性或潜在传染性产品的处理程序，每个实验室都有责任根据其实验的类型和危险性级别，进行废物和污物的处理，同时要严格依照有关规定对待所有的废物和污物。

免责声明

1.  试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

2.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。

小鼠皮质醇（Cortisol）ELISA检测试剂盒的正确使用方法