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原位杂交实验的实验流程和样本处理注意事项

更新时间:2023-08-29      浏览次数:1465

 原位杂交实验的实验流程和样本处理注意事项

上海信帆提供原位杂交实验检测服务。原位杂交实验通常流程由组织切片+探针+DAB染色+扫片或者拍照构成,那么详细的操作步骤和对样本的处理要求具体是什么呢,让我们一起来探索一下吧!

实验流程:

  1、组织固定:组织取出洗净后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

  2、脱水:组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡,包埋。

  3、切片:石蜡经切片机切片,摊片机捞片,62°烤箱烤片2h。

  4、石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

  5、消化:根据组织固定时间长短,切片于修复液中煮沸10-15分钟,自然冷却。后基因笔画圈,根据不同组织不同指标特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

  6、阻断内源性过氧化物酶:滴加3%甲醇-H2O2,室温避光孵育15min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

  7、预杂交:滴加预杂交液,37°C孵育1h。

  8、杂交:倾去预杂交液,滴加含探针杂交液, 恒温箱 37度杂交过夜。

  9、杂交后洗涤:洗去杂交液,2×SSC,37°C 洗10min,1×SSC,37°C洗2×5min,0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多,可以增加甲酰胺洗涤。

  10、滴加封闭液:滴加封闭血清 BSA。室温30min。

  11、滴加鼠抗高辛标记过氧化物酶(anti-DIG-HRP):倾去封闭液,滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min,后PBS洗4次×5min。

  12、DAB显色:切片稍甩干后,在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,阳性为棕黄色,纯水冲洗切片终止显色。

  13、复染细胞核:Harris苏木素复染3min左右,自来水洗,1%盐酸酒精分化数秒,自来水洗,氨水返蓝,流水冲洗。

  14、脱水封片:将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明,将切片从二甲苯中拿出稍晾干后,中性树胶封片。

  15、显微镜检,图像采集分析。


  结果判读:

  阳性为棕黄色,细胞核为蓝色。


送样要求:

1、切片前处理要求:新鲜组织干冰运输后做冰冻切片;或取2mm左右厚度的新鲜组织,5min内投入原位杂交固定液内固定,4℃低温保存运输,切勿冷冻结冰,尽快包埋切片后进行原位杂交实验,固定时间过长影响核酸检出率;

2、冰冻切片:冰冻切片-20℃运输;

3、石蜡切片:石蜡切片常温运输;

4、细胞爬片:细胞爬片加原位杂交固定液固定15min后,换无酶PBS,密封,4℃运输。

 

 原位杂交实验的实验流程和样本处理注意事项

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