NADH检测试剂盒应该如何正确使用

NADH检测试剂盒应该如何正确使用

上海信帆生物供应NADH检测试剂盒，产品现货供应！

产品简介：
 NAD+/NADH检测试剂盒(WST-8法) (NAD+/NADH Assay Kit with WST-8)是一种基于WST-8的显色反应，通过比色
法来检测细胞、组织或其它样品中NAD+ (氧化型辅酶I)和NADH (还原型辅酶I)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。
 NAD+/NADH以及NADP+/NADPH的传统检测方法是检测NADH或者NADPH在340nm处吸收波长的变化，该方法灵敏度较
低并易受样品中有类似紫外吸收物质的干扰，并且在紫外检测过程中通常需要加大检测样品量以弥补NADH在340nm处吸
光度过小的不足，因此该传统检测方法具有很大的局限性。
 WST-8是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被一些脱
氢酶还原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液来溶解；而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，
可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和
MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。
 WST-8 和WST-1 相比，检测灵敏度更高，更易溶解，并且更加稳定。
 本试剂盒使用便捷，无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的NAD+和NADH，并且能特异性检测NAD+和NADH，而不检
测NADP+和NADPH。本试剂盒可以检测含量低至0.25μM (5pmol)的NAD+或NADH，在0.25μM (5pmol)至10μM (200pmol)之
间呈现良好的线性关系。
 NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)是所有细胞中都存在的一种辅酶，包括NAD+ (氧化型)和
NADH (还原型)两种形式。NAD+既是氧化还原反应过程中传递电子的辅酶，又可以作为很多酶的底物来参与细胞内反应。
例如Sirtuins家族的Sirt1等去乙酰化酶就需要以NAD+作为底物进行去乙酰化反应来调控蛋白的乙酰化水平从而参与细胞的
生命活动过程。NAD+在细胞和体内发挥着重要的功能，其合成和降解及其产物参与细胞凋亡、代谢调控和基因表达的调
控等，并且NAD+的减少是细胞死亡的主要因素之一。虽然NMNAT (nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase)是
NAD+的合成酶，包括Nmnat1、Nmnat2和Nmnat3，但NAMPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase)通常被认为是NAD+合
成的限速酶。NAD+在调节细胞氧化还原状态方面的重要性以及调控信号通路及转录方面的功能，使得NAD+及其合成和消
耗的酶成为多种疾病的潜在药物靶点。

包装清单：
产品编号 产品名称  包装
0175-1    乙醇脱氢酶 220μl
0175-2     显色液 1.1ml
0175-3     NADH 5mg
0175-4    NADH配制液 0.8ml
0175-5    NAD+/NADH提取液 60ml
0175-6    反应缓冲液 10ml
— 说明书 1份
保存条件：
-20ºC保存，一年有效。显色液(0175-2)和NADH (0175-3)须-20ºC避光保存。NADH配制成溶液后，须适当分装后-80ºC保
存。所有试剂避免反复冻融。
注意事项：
 本试剂盒中的所有试剂均需要冷冻保存，请严格按照保存条件进行保存。如果不是一次用完，为避免反复冻融导致产品失
效，请适当分装后保存。
 NADH不太稳定，取出NADH后请尽快使用。如果发现标准曲线不理想，很有可能是标准品发生了降解。
 由于NAD+/NADH提取液比较粘稠，以该提取液作为稀释液时，无论对标准品还是样品进行稀释，在稀释过程中务必保证
稀释均匀，否则易造成实验数据产生较大波动。
 在样品加样和混匀过程中，须尽量避免产生气泡，以免影响终的吸光度测定。
 如果不能非常严格地控制反应温度和反应时间，每次检测都需要设置标准曲线。
 如果样品溶液中NAD+和NADH浓度过高或过低，不在试剂盒的线性检测范围内时，可适当调整样品或者提取液的用量。
 由于NAD+和NADH很不稳定，在冻存过程中较易降解，所以宜尽量使用新鲜样品进行检测。
 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于研究诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1. 样品的准备：
a. 细胞样品的准备：对于贴壁细胞，约1×106个细胞(大约相当于6孔板一个孔长满的细胞数量)，吸净培养液，用移液器加
入200μl的NAD+/NADH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；对于悬浮细胞，约1×106个细胞，600g离心5分钟，吸
净培养液，用移液器加入200μl冰浴预冷的NAD+/NADH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；裂解过程在室温或
冰上操作均可。随后12,000g，4ºC离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。
b. 组织样品的准备：冰上预冷的PBS洗涤组织后，称取约10-30mg的组织样品，用剪刀剪碎，置于匀浆器中，加入400μl的
NAD+/NADH提取液在室温或冰上进行匀浆。随后12,000g，4ºC离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。
2. 试剂盒的准备工作：
a. NADH标准品的配制：吸取655μl NADH配制液，充分溶解本试剂盒提供的5mg NADH后即得到10mM NADH标准品。
10mM NADH标准品请适当分装后-80ºC避光保存。
b. NADH标准曲线的设置：将10mM的NADH标准品用NAD+/NADH提取液稀释成适当的浓度梯度，如初次检测可以设置
0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10μM这几个浓度，检测时96孔板中每孔加入20μl的标准品，相当于每孔为0、5、10、
20、40、80、120、160、200pmol的NADH。如有必要，在后续的实验中可以根据样品中的NADH含量对标准品的浓度
范围进行适当调整。其中浓度为0μM的点为空白对照点，仅含NAD+/NADH提取液。注意：由于NADH很不稳定，故配
制后需尽快使用。
c. 乙醇脱氢酶工作液的配制：将乙醇脱氢酶用反应缓冲液稀释45倍，例如2μl乙醇脱氢酶加入到88μl的反应缓冲液中，即
可获得90μl的乙醇脱氢酶工作液。每个标准品或样品的检测需要使用90μl的乙醇脱氢酶工作液，请根据所需检测的标准
品和样品的数量，配制适量的乙醇脱氢酶工作液，并注意现配现用。
3. 样品测定：
a. 样品中NAD+和NADH的总量的测定：吸取20μl待测样品至96孔板中，为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。后续
如果发现样品中的NAD+和NADH的总量过高，超出标准曲线的范围，则需要用NAD+/NADH提取液将样品适当稀释后
再进行检测；总量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。
b. 样品中NAD+、NADH 的含量或者NAD+/NADH比值的测定：吸取50-100μl待测样品于离心管中，60ºC水浴或PCR仪上加
热30分钟以分解NAD+。如果加热后产生不溶物，则需10,000g，室温或4ºC离心5分钟，吸取20μl上清液作为待测样品至
96孔板中，为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的NAD+或NADH的含量过高，超出标准曲
线的范围，则需要用NAD+/NADH提取液将样品适当稀释后再进行检测；含量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。
c. 请参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。加入乙醇脱氢酶工作液后充分混匀。

e. 如果希望更加精确地来表述NAD+和NADH总量或各自的含量，可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。终用单位蛋白量中NAD+和NADH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。 

NADH检测试剂盒应该如何正确使用