线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）的说明介绍

    本试剂盒采用JC-1一种阳离子脂质荧光染料作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存在，高浓度时以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同，但均可在流式细胞仪绿色（FL-1）通道检测出绿色荧光，JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位（△y）具有极性，JC-1依赖于△y的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光；可被流式细胞仪的红色（FL-2）通道检测到，而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。根椐这一特征检测线粒体膜电位的变化。本试剂盒可应用于细胞、组织或纯化的线粒体膜电位检测。

操作步骤(仅供参考)：

1、 配制JC-1染色工作液：

取适量JC-1 Stain (200×)，按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀释JC-1，剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2ml JC-1 Buffer(5×)，混匀后即为JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1ml，其它培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推。

2、 设置阳性对照：

推荐CCCP(10mM)加入到细胞培养液中处理细胞。随后按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。

3、对于悬浮细胞：

a. 取1～6×105细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

b. 加入0.5ml JC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育。

c. 在孵育期间，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

d. 37℃孵育结束后， 4℃ 600g离心3～4min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

f. 再用JC-1 Buffer(1×)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

4、对于贴壁细胞：

注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，应先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

a.吸除6孔板培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

b. 加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育。

c. 在孵育期间，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

d. 37℃孵育结束后， 吸除上清，用JC-1 Buffer(1×)洗涤2次。

e. 加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

f. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5、对于纯化的线粒体：

a. 把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀释5倍。

b. 0.9ml 5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1ml总蛋白量为10～100μg纯化的线粒体。

c. 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描，激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475～520nm范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。

d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。

6、荧光观测和结果分析：

检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1法)注意事项
1，JC-1（200×）在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

2，请勿把JC-1染色缓冲液（5×）全部配制成JC-1染色缓冲液（1×），本试剂盒使用过程中需直接使用JC-1染色缓冲液（5×）。

3，如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在37℃加热。 JC-1探针装载完并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。

4，应避免反复冻融。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×)，否则导致JC-1很难充分溶解，严重影响后续的检测。可以20～25℃水浴温育片刻至全部融解后使用.

5，装载完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗涤时，尽量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右，此时的洗涤效果较好。

6，CCCP为线粒体电子传递链抑制剂，有毒，请注意小心防护。

 7，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。