MMP明胶酶谱试剂盒的正确使用方法-上海信帆生物

MMP明胶酶谱试剂盒的正确使用方法-上海信帆生物

如果您对基质金属蛋白酶MMP2/MMP9感兴趣，欢迎上海信帆生物科技有限公司了解！

明胶酶谱法试剂盒检测步骤：

1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。

2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样。

注：因为全血成分复杂,MMP活性较低，的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照

3 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。

5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。

6 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。

7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。

如果您对基质金属蛋白酶MMP2，MMP9感兴趣，欢迎上海信帆生物科技有限公司！

MMP明胶酶谱试剂盒的正确使用方法-上海信帆生物

使用上海信帆生物明胶酶谱法试剂盒发表的文章：

《绿茶多酚EGCG增强动脉粥样硬化斑块稳定性及其相关机制研究》

*部分绿茶多酚EGCG增强高脂饮食喂养ApoE缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性目的:急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)是指一系列研究严重的急性心肌缺血性疾病,主要包括不稳定型心绞痛以及急性ST段抬高或非ST段抬高型心肌梗死。目前大量研究资料已证实,急性冠脉综合征发病的zui主要病理生理基础是冠状动脉中不稳定型动脉粥样硬化斑块的破裂,引起冠状动脉内急性血栓形成,继而引起心肌严重的缺血、缺氧。近年来,多项研究流行病学研究报道称,饮用绿茶可以明显降低冠心病的发病率。绿茶的抗动脉粥样硬化作用主要原因是绿茶中含有大量的多酚类化合物,其中含量zui多的为儿茶素。绿茶中儿茶素主要成分包括表儿茶素(EC),表儿茶素没食子酸酯(ECG),表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。在这些成分中,以EGCG含量zui丰富,活性zui强,已被证明具有多种药理学作用和生物学特性。我们进行本研究主要目的就是为了证实绿茶多酚EGCG是否能够增强高脂饮食喂养ApoE缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性并探讨其可能的相关机制。

方法:30只雄性ApoE缺陷小鼠(6周龄,体重18-20g)被随机分为对照组(n=15)以及EGCG组(n=15)这些小鼠均使用含有21%脂肪以及0.15%胆固醇的高脂饮食喂养。EGCG组以及对照组分别给予EGCG(10mg/kg)或者同等剂量的0.9%生理盐水进行腹腔注射共16周。随后麻醉处死小鼠,取小鼠头臂干动脉并予固定石蜡包埋。小鼠头臂干横切面进行HE染色以及Masson染色分别评估动脉粥样硬化斑块形态以及胶原含量。此外,使用免疫组织化学染色的方法分析小鼠斑块中巨噬细胞以及平滑肌细胞成分的比例。蛋白质印迹法(Western blot)用来检测斑块中蛋白表达水平,明胶酶谱法用来检测斑块中基质金属蛋白酶的活性。

zui后,我们用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠血清炎症因子单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果:高脂饮食喂养16周后,ApoE缺陷小鼠头臂干动脉近端横切面HE染色可见明显的动脉粥样硬化斑块形成,提示造模成功。另外,与对照组相比,EGCG组ApoE缺陷头臂干动脉近端粥样硬化病变程度明显减轻。Masson染色结果提示,EGCG干预后动脉粥样硬化斑块中胶原成分明显增加。免疫组织化学染色发现EGCG组斑块中巨噬细胞比例明显降低,而斑块中平滑肌成分显著增高。此外,Western blot检测发现EGCG可以显著降低ApoE缺陷小鼠斑块中基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)的表达。同样,明胶酶谱法结果提示EGCG组斑块中MMP-2和-9活性较对照组明显减低。

zui后,与对照组相比,EGCG腹腔注射后,ApoE缺陷小鼠血清炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α以及IFN-γ水平显著降低。结论:本研究结果提示,绿茶多酚EGCG能够增强高脂饮食喂养ApoE缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性。此外,EGCG增强斑块稳定性的内在机制可能与其抑制多种炎症因子、基质金属蛋白酶诱导因子以及机制金属蛋白酶表达有关。第二部分EGCG通过与67LR相互作用抑制巨噬细胞基质金属蛋白酶诱导因子以及基质金属蛋白酶-9的表达目的:大量研究资料表明在不稳定型动脉粥样硬化破裂过程中,由单核细胞和巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)以及基质金属蛋白酶发挥着十分关键的作用。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中zui主要的多酚类化合物,资料显示EGCG具有多种药理学活性并且能够对心血管发挥保护性作用。

近年来,实验已证实相对分子量为67000的层粘连蛋白受体(67LR)为EGCG主要膜表面受体,EGCG与67LR相互作用后可发挥多种生物学效应。本研究的主要目的就是为了评估EGCG是否能够抑制佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导分化巨噬细胞 EMMPRIN 以及 MMP-9 的表达,并且探讨其可能的相关机制。方法:使用不同浓度的EGCG预处理人单核细胞THP-1细胞1小时后,以佛波酯(PMA,100nmol/L)诱导48小时使其分化为巨噬细胞。实验中使用小干扰RNA(Small-interfering RNA,siRNA)沉默EMMPRIN基因表达。实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)测定 EMMPRIN 和 MMP-9 mRNA 表达,蛋白质印迹法(Western Blot)检测EMMPRIN以及MMP-9蛋白表达,使用明胶酶谱法检测MMP-9的活性。

结果:研究发现EGCG(10-50μmol/L)可以明显抑制巨噬细胞EMMPRIN以及MMP-9的表达,抑制作用呈现剂量-效应关系,随着EGCG浓度的增加,其抑制作用明显增强。Extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)、p38 以及c-Jun N-terminal kinase(JNK)信号通路与EMMPRIN和MMP-9的表达密切相关,EGCG同样能够显著抑制ERK1/2、p38以及JNK信号转导通路的激活。

使用基因沉默的方法下调巨噬细胞EMMPRIN表达可以使MMP-9的表达以及活性明显下降,提示在EGCG主要通过抑制巨噬细胞EMMPRIN合成进而抑制MMP-9的表达。为了进一步证明EGCG是否通过67LR相互作用发挥其抑制EMMPRIN以及MMP-9表达的作用,我们使用67LR抗体封闭巨噬细胞表面67LR以阻断EGCG与67LR的相互作用,结果发现EGCG对巨噬细胞EMMPRIN以及MMP-9表达的抑制作用明显减弱,同样67LR抗体阻断了 EGCG对于ERK1/2、p38以及JNK信号转导通路的抑制作用。

结论:我们的研究结果表明,EGCG可以通过抑制ERK1/2、p38以及JNK信号转导通路的激活进而降低巨噬细胞EMMPRIN和MMP-9表达,这些生物学效应是通过EGCG与67LR相互作用介导的。另外,研究发现在EGCG抑制MMP-9表达的过程中,EMMPRIN发挥着主要作用。以上研究结果提示绿茶多酚EGCG可能成为一种稳定动脉粥样硬化斑块的治疗剂。

MMP明胶酶谱试剂盒的正确使用方法-上海信帆生物