JC-1法检测线粒体膜电位，以及检测线粒体膜电位的操作步骤

JC-1法检测线粒体膜电位，以及检测线粒体膜电位的操作步骤！

线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1 法)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一种以 JC-1 为荧光探针，快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化的试剂盒，可以用于早期的细胞凋亡检测，CCCP 作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于研究诊断或其他用途。

产品组成：

操作步骤(仅供参考)：

1、配制 JC-1 染色工作液：

取适量 JC-1 Stain (200×)，按照每 50μl JC-1 Stain (200×)加入 8ml ddH₂O 的比例稀释 JC-1，剧烈 Vortex 充分溶解并混匀 JC-1 Stain。然后再加入 2ml JC-1 Buffer(5×)，

混匀后即为 JC-1 染色工作液。6 孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量为 1ml，其它培养器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此类推；对于细胞悬液每 0.5～1.0×10⁶ 细胞需 0.5ml JC-1 染色工作液。

2、设置阳性对照：

推荐 CCCP(10mM)按照 1:1000 的比例加入到细胞培养液中，稀释至 10μM，处理细胞20min。随后按照下述方法装载 JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常 10μM CCCP 处理 20min 后线粒体的膜电位会*丧失，JC-1 染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经 JC-1 染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。

3、对于悬浮细胞：

• 取 1～6×10⁵ 细胞，重悬于 0.5ml 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。

• 加入 0.5ml JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20min。

• 在孵育期间，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例，配制适量的 JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

• 37℃孵育结束后， 4℃ 600g 离心 3～4min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

• 用 JC-1 Buffer(1×)洗涤 2 次：加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重悬细胞，4℃ 600g 离心3～4min，沉淀细胞，弃上清。再加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重悬细胞，4℃ 600g 离心

3～4min，沉淀细胞，弃上清。

• 再用少量 JC-1 Buffer(1×)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

JC-1法检测线粒体膜电位，以及检测线粒体膜电位的操作步骤！

4、对于贴壁细胞：

注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，应先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

• 吸除 6 孔板培养液，根据具体实验如有必要可以用 PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入 1ml 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。

• 加入 1ml JC-1 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20min。

• 在孵育期间，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例，配制适量的 JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

• 37℃孵育结束后，吸除上清，用 JC-1 Buffer(1×)洗涤 2 次。

• 加入 2ml 细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。

• 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5、对于纯化的线粒体：

• 把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 Buffer(1×)稀释 5 倍。

• 0.9ml JC-1 染色工作液中加入 0.1ml 总蛋白量为 10～100μg 纯化的线粒体。

• 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描，激发波长为 485nm，发射波长为 590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为 485nm 时，可以在 475～520nm 范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤 6

中的波长设置进行荧光检测。 d. 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤 6。

6、荧光观测和结果分析：

检测 JC-1 单体时可以把激发光设置为 490nm，发射光设置为 530nm；检测 JC-1 聚合物时，可以把激发光设置为 525nm，发射光设置为 590nm。注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在zui大激发波长和zui大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测 JC-1 单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察 GFP 或 FITC 时的设置；检测 JC-1 聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或 Cy3 时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

注意事项：

1、 JC-1 Stain(200×)应*溶解混匀后使用，但应避免反复冻融。必须先把 JC-1 用 ddH₂O 充分溶解混匀后，才可加入 JC-1 Buffer(1×)。不可先配制 JC-1 Buffer(1×)再加入

JC-1 Stain(200×)，否则导致 JC-1 很难充分溶解，严重影响后续的检测。

2、 对于 6 孔板中的样品，本试剂盒共可以检测 100 个样品；对于 12 孔中的样品，本试剂盒共可以检测 200 个样品。

3、 装载完 JC-1 后用 JC-1 Buffer(1×)洗涤时，尽量使 JC-1 Buffer(1×)保持 4℃左右，此时的洗涤效果较好。

4、 JC-1 探针装载完并洗涤后尽量在 30min 内完成后续检测，在检测前需冰浴保存。

5、 勿把 JC-1 Buffer(5×)全部配制成 1×，因为操作过程中需直接使用 JC-1 Buffer(5×)。6、 如 JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必须全部溶解后才能使用，为促进溶解可以在 37℃加热。7、 CCCP 为线粒体电子传递链抑制剂，有一定毒性，请注意小心防护。

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